基于FFPE样本的RNA signature转化研究障碍

随着转录组学检测技术的快速发展，RNA signature相关的转化研究呈指数级增长，尤其是在挖掘免疫治疗预测标志物和预后标志物领域。目前已有多款RNA signature产品获得FDA批准，如大家熟知的MammaPrint（2007年上市，用于预测乳腺癌复发风险） 以及Prosigna（2013年上市，用于乳腺癌预后分型）。

图1. RNA signature研究呈指数级增长【1】

在RNA signature研究中最常用的样本是石蜡包埋组织（FFPE），取样方式有手术、穿刺活检、内镜活检等。FFPE样本可以长期常温保存，但是制备和贮存过程中，组织经福尔马林固定、石蜡包埋后很容易引起核酸的交联和降解，而且样本保存时间越长，降解越严重，从FFPE样本中获得合格的mRNA用于转录组分析是一项极大的挑战。临床实践显示，大约有一半的FFPE样本会因为mRNA质控不合格而被剔除，严重限制了研究的可行性和结果可靠性。目前常用的基因表达水平检测技术大多依赖逆转录和PCR扩增，PCR带来的偏好性不可避免的会导致数据失真，往往要严格的设置技术重复和生物学重复。这些来源于样本本身及检测技术的难题均限制了FFPE样本在临床转化研究中的有效应用！众所周知，临床研究中样本是宝贵资源，获取的FFPE样本有一半无法用于检测分析，这对既定的基因表达研究是一个重创，会极大影响研究的完整性。

nCounter基因表达平台针对上述源于样本本身及其他常规基因表达检测技术的难题能够提供有效的解决方案！

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nCounter基因表达平台及技术性能

nCounter技术平台于2008年开启商业化应用，基于液相杂交技术，采用荧光条形码探针对实现高通量基因表达的数字化定量。有效解决FFPE样本核酸降解难题，专注于生物标志物等临床转化研究应用。

nCounter技术原理简介【2】

图2. nCounter技术原理及工作流程

针对每个目标mRNA的探针是成对的：报告探针和捕获探针。报告探针(Reporter Probe)包含50个核苷酸，并在3’末端标记了一段荧光barcode。这50个核苷酸与目的mRNA分子互补，可以发生特异性结合；荧光barcode由6个荧光基团而成，每个荧光基团有4种颜色，每一种排列组合的荧光条码用于标记一种待检mRNA，该种荧光条码在样本中出现的次数即代表其标记的mRNA在样本中的检出量。捕获探针(Capture Probe)也包含50个核苷酸，并在5’末端连接有生物素；这50个核苷酸序列与目标mRNA互补，特异性捕获目标分子，生物素可以与固定在Cartridge上的亲和素结合；

来源于FFPE等样本的总RNA与探针对试剂混合，65℃杂交过夜（16-24h）；

液相杂交反应完成后，将反应体系转移至Cartridge上的样本流道内，经过一系列的洗脱过程，去除非靶核酸和游离的探针，纯化靶mRNA和探针对杂交复合物，经生物素和亲和素的相互作用，杂交复合物被固定并平铺于Cartridge上；

将Cartridge转移至扫描仪上进行信号采集并计数，并列表标识。每个荧光基团都带有电荷，通电后在电场的作用下，荧光基团倒向一边并被拉直，便于荧光识别和计数。

nCounter技术性能及其应用优势

(1) 对FFPE样本中降解程度极高的核酸也能有效检出

这一优越性能源于nCounter的技术开发逻辑，即采用两段长度各为50 nt的荧光条码标记探针对与待检基因mRNA直接杂交，两段探针总长100 nt。在FFPE样本中，即使核酸降解较为严重，100 nt以上的目标序列依旧有一定的存在概率，可通过nCounter对这些目标分子进行定量，进一步分析组间基因表达差异。应用实践证实总RNA质控后RIN＞2即可采用nCounter技术进行有效的基因表达检测分析，而RNA-seq要求RIN＞8.5，nCounter技术比RNA-seq具有更高的适用性，尤其是在样本珍贵稀少且质量不高的肿瘤转化研究领域！

图3. nCounter技术平台对于采用FFPE样本的临床转化研究适用性更高【3】

（2）nCounter技术平台对样本的需求量相对友好

nCounter不止对样本质量要求比RNA-seq低，在样本量的要求上也比RNA-seq更友好。nCounter平台对样本量的要求为：手术样本（5μm厚切片）3-5 slides /sample，活检穿刺样本（5μm厚切片）8 slides/sample。RNA-seq技术对样本量的要求是nCounter平台的2-3倍，导致活检穿刺的样本通常因为样本量不足无法开展RNA-seq检测。

这一性能优势源于单分子成像带来的极高灵敏度。荧光条码标记由4种颜色6个不同位置的荧光基团按照不同的排列组合构成。组合而成的荧光基团信号强度足以在单分子水平被荧光显微镜识别，同时提供较宽的动态检测范围（可达5-6个log）。

（3）在产出数据的准确性及精准度层面，nCounter平台也更胜一筹

首先，对FFPE样本中的mRNA分子用荧光barcode直接标记，直接检测计数，无需反转录和扩增，从而避免了逆转录和PCR扩增带来的偏好性，比传统的RNA检测技术具有更高的精准度和重复性。

图4. 不同基因表达技术平台因技术流程不同而带来的数据bias状况

2011年Khan【4】带领的团队对4个RNA检测平台进行了技术对比评估，包括qPCR、microarray、RNA-seq和nCounter。结果显示相同的样本，nCounter平台的检测结果与qPCR结果高度一致（ρ=0.992），且nCounter平台的精准度更高。

图5. nCounter得到的基因表达差异结果与qPCR一致，但精准度更高

同样的，Reis【5】团队在2011年发表于BMC Biotech 的文章也显示，来源于同一个组织块的新鲜冷冻样本和FFPE样本，利用nCounter平台及qPCR平台开展基因表达检测，相比qPCR，nCounter平台的检测结果在两种样本类型中一致性更高（R：0.9 vs. 0.5）。

图6. 相同组织样本分别制成FFPE及Fresh Frozen基因表达nCounter得到了比qPCR更好的检测结果

除此之外，nCounter平台稳定性更高，技术重复结果一致性R2可达0.9999，这种高度重复性允许实验设计中免去技术重复的设置，节省样本的同时降低项目投入；Northcott P.E【6】等人2011年发表文章中显示在不同的实验室中nCounter也显示了卓越的结果重复性，研究团队将同一个髓母细胞瘤样本分成3份，送至3个国家的不同实验室分别开展nCounter基因表达检测用于髓母细胞瘤的分子分型，结果显示3个实验室的分型高度一致（R2 Site1 v Site 2 = 0.97，R2 Site1 v Site 3 = 0.98），这提示nCounter平台非常适用于多中心临床研究。

图7. 髓母细胞瘤分子分型结果

综上所述，nCounter技术具有高灵敏度、高重复性、没有反转录和PCR扩增引入的偏好性、且对FFPE样本十分友好，一经推出便得到了肿瘤、免疫等领域研究者的广泛的关注和认可。基于nCounter平台，研究者已开发了多款临床转化产品，有的甚至获得了FDA的上市许可，如用于淋巴瘤细胞起源（COO）分型的25基因signature Lymph2Cx、用于乳腺癌预后分型的Prosigna 试剂盒（FDA批准上市）以及用于免疫检查点抑制剂用药疗效预测的 signature TIS（Tumor inflammation score）。相信未来在nCounter平台上会有更多的RNA signature类生物标志物被开发并完成临床转化！

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关于TIS

TIS是NanoString联合默沙东在接受K药治疗的19名黑色素瘤患者的RNA数据中发现的18个与ICIs临床反应相关的基因。该Signature已在多癌种研究数据中得到验证。NanoString 已授权裕策生物作为TIS分析软件的中国首家CRO服务商。

参考文献：

1.https://www.almacgroup.com/diagnostics/wp-content/uploads/sites/3/2020/12/41225-ALMAC-Blog-Post-Gene-Expression-FINAL-AW-AM5951.pdf

2. Leroy Hood，et al. Nat Biotechnol. 2008 Mar;26(3):317-25. doi: 10.1038/nbt1385. Epub 2008 Feb 17.

3. Omolo et al. BMC Medical Genomics (2016) 9:65 DOI 10.1186/s12920-016-0225-2

4. Mona Khan Cell et al. 2011 Nov 11;147(4):907-21. doi: 10.1016/j.cell.2011.09.049.

5. Reis et al. BMC Biotechnol. 2011 May 9;11:46. doi: 10.1186/1472-6750-11-46.

6. Northcott P.E et al. Acta Neuropathol. 2012 Apr;123(4):615-26. doi: 10.1007/s00401-011-0899-7. Epub 2011 Nov 6.