人表皮生长因子受体-2阳性 (HER2+)乳腺癌占所有乳腺癌的20% - 25%。HER2+乳腺癌患者预后一般不佳，通过有效的HER2靶向治疗，这些患者的预后得到了显著改善。然而，HER2+乳腺癌患者的肿瘤微环境(TME)中免疫细胞、基质细胞和肿瘤细胞的分子亚型和空间相互作用尚未明确，所以临床对预防此类乳腺癌的复发和转移仍没有很好的解决方案。本研究中乔治敦大学医院研究团队利用NanoString的GeoMx® Digital Spatial Profiler (DSP)技术和NanoString nCounter PanCancer IO 360™(IO 360)检测Panel，对多个HER2+乳腺癌患者的原发灶和转移灶的TME进行分析，以了解在HER2+乳腺癌患者的诊疗过程中肿瘤复发或转移后的免疫微环境变化。该研究发表在Journal of Translational Medicine （IF=5.531）上，题目为“The tumor immune microenvironment of primary and metastatic HER2-positive breast cancers utilizing gene expression and spatial proteomic profiling”。 

试验设计

研究入组样本： 8例HER2+乳腺癌患者的15个福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本，其中2例患者有三个不同的采样时间点，3例患者有两个不同的采样时间点，3例患者有单一的采样时间点。其中HER2+乳腺癌原发灶10例，软组织肿瘤2例，脑转移灶2例，肺转移灶1例（病人具体信息见Table 1）。

检测方法：NanoString GeoMx® Digital Spatial Profiler (DSP)上进行蛋白组学的检测分析，NanoString nCounter上进行 PanCancer IO 360™ (IO 360) Panel 770个基因和额外客制化的28个基因的 PAM50 Signature 的表达谱检测分析；

研究发现

1. IO 360联合DSP分析揭示HER2+乳腺癌患者的原发灶相较转移灶具有更高的免疫原性

根据IO 360 Signatures检测对HER2+乳腺癌患者原发灶和转移灶聚类分析，其中8/10原发灶肿瘤炎性指数评分（Tumor Inflammation Signature（TIS））明显偏高(图1A, Table 1 )。并且原发灶中B细胞表达丰度明显高于转移灶(图1B )。在HER2+乳腺癌患者原发灶中，与免疫激活和转运相关的基因表达也显著升高，包括CD79A、CXCL12、CD28和SFRP4(图1C)。

图1. 原发灶 VS 转移灶的IO 360基因表达分析

研究者对HER2+乳腺癌肿瘤区(PanCK+)和基质区(PanCK-)不同免疫浸润程度(即cold、warm、hot)的ROI进行空间分析，寻找原发灶和转移灶之间的差异。DSP实验设计如图2A所示。研究发现每个患者hot、warm、cold的ROI免疫浸润程度各不相同。原发灶中免疫细胞数量最多，转移灶中免疫细胞数量最少（图2B），免疫相关蛋白在原发灶中表达较高，特别是肿瘤浸润淋巴细胞：CD3、CD8 (图2C)。

图2. 原发灶 VS 转移灶的DSP蛋白表达分析

2. HER2+乳腺癌患者成对样本DSP的分析结果提示患者潜在免疫逃逸机制

研究患者群体中，患者1和患者2有三个不同的采样时间点，分别为：Primary 1-原发灶活检样本；Primary 2-新辅助治疗后的残留病灶二次活检样本；Met-晚期转移灶样本；患者1和患者2的原发灶与转移灶相比，免疫细胞水平表达明显更高（图3A&4A）；尽管两位患者接受不同的诊疗方案，仍然得到了一致的结论。患者1的蛋白表达分析显示，新辅助治疗后的残留病灶中，基质区域潜在的免疫靶向蛋白标志物的表达显著高于原发灶和转移灶（图3B），此发现与该研究中患者4和患者7所揭示的情况类似，然而患者1的转移灶中免疫靶向蛋白标志物的表达较低（图3B），此发现提示我们免疫靶向蛋白标志物表达的降低可能会导致癌细胞发生免疫逃逸，从而发生癌症的转移。

图3.  患者1原发灶、残留病灶及转移灶中DSP蛋白表达分析

图4.  患者2原发灶、残留病灶及转移灶DSP蛋白表达分析

3. DSP蛋白组学分析揭示HER2+乳腺癌患者潜在的免疫治疗生物标志物

患者1的DSP蛋白数据分析显示，与原发灶相比，残留病灶中B7-H3、Bcl-2、CTLA4、LAG3、Tim-3、PD1、PDL1和STING的表达显著增加（图3C），该结果表明患者在接受紫杉醇和曲妥珠单抗治疗后可能增加了TME中的免疫活性。肺转移灶中免疫相关蛋白的总表达量较低(图3A&B)。患者2的DSP蛋白数据分析显示，原发灶中免疫蛋白的表达均高于残留病灶和转移灶，该结果提示我们，患者接受新辅助化疗后免疫细胞的减少(图4B)。在残留病灶中，B7-H3、Bcl-2、CTLA4、LAG3、PD1、PDL1的表达明显下降，随后在患者复发时上述基因表达又有所增加，接近最初诊断时的表达水平(图4C)。

针对患者4和患者7的DSP蛋白数据分析显示，在初始治疗后Bcl-2、CD20、LAG3、MET (PanCK-)、PTEN、AKT (PanCK-)的表达均有所上调。通过以上成对样本的蛋白分析，提示HER2+乳腺癌患者不同病灶中B7-H3、LAG3、CTLA4及Bcl-2等基因的表达差异，同时也为目前在研项目中所关注的乳腺癌亚型的免疫治疗生物标志物给到一定的指导作用。

研究结论

本研究强调了TME内肿瘤区和基质区空间分辨率的重要性，以观察免疫治疗生物标志物的表达差异。更清晰的展示了HER2+乳腺癌患者的TME和基因表达谱，并且该研究提示我们在HER2+乳腺癌患者疾病的不同阶段，蛋白组学的免疫标志物检测可能会为患者的诊疗起到一定的指导作用，从而能够为患者提供个性化的诊疗方案以改善患者预后。

该研究联合应用NanoString nCounter平台和DSP平台探究肿瘤患者免疫微环境，分析方案优势显著：

通过NanoString nCounter平台快速锁定有效反应和差异信号的基因表达情况；

结合更灵活的空间多组学技术，在同一患者不同采样时间点的切片上进行有效分析区域圈选，对nCounter平台检测到的基因表达与DSP平台检测到的蛋白表达进行关联，开展相应表达特征微环境分析;

对样本进行直观的可视化免疫微环境分析，同时多组学的结合提高了分析内容的维度和数据的可信度；