前言

胰腺癌（PDAC）是一种高度致命的消化道恶性肿瘤，其独特的肿瘤微环境使基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂治疗收效甚微。麻省理工学院团队从胰腺癌特异性新抗原出发，在胰腺癌中发现了功能类似于PD-1/PD-L1的刹车系统—CD155/TIGIT会导致PDAC免疫逃逸。在临床前小鼠模型中开发了一种免疫治疗策略—PD-1抑制剂+TIGIT抑制剂+CD40激动剂，可以消除小鼠的胰腺肿瘤，为胰腺癌免疫治疗带来新希望。研究者应用空间蛋白组技术结合单细胞测序等多种技术，从组织空间等多角度深刻阐释了该策略背后的分子机制，其研究结果发表在Cancer Cell（IF=31.743），标题为“The CD155/TIGIT axis promotes and maintains immune evasion in neoantigen-expressing pancreatic cancer”。

研究路线

本研究开发胰腺癌肿瘤新生抗原表位预测方法，构建三种不同的临床前小鼠模型，揭示了部分胰腺癌患者含有可预测的高亲和力表位。利用单细胞测序技术、流式细胞技术、免疫组化等技术层层推进，在临床前小鼠模型中发现了对胰腺癌有效的联合免疫治疗方案。利用DSP空间蛋白组学技术在空间水平揭示了该治疗方案在胰腺癌组织空间内引起的免疫微环境变化。

研究发现

1、PDAC高亲和力新表位的预测和免疫逃逸类器官模型的构建

前期研究推测胰腺癌对免疫检查点抑制剂对胰腺癌应答不高可能是由于胰腺癌中很少有可预测的新生抗原（neoantigens），导致T细胞攻击目标不足，在T细胞受到免疫检查点抑制剂的刺激时，并不能识别和破坏胰腺癌细胞。因此，寻找更强的肿瘤特异性新生抗原是成功的关键。研究者开发了一个新生抗原表位预测方法，包括HLA等位基因分型、突变调用、变异效应预测和多肽MHC-Ⅰ结合预测，同时考虑由错义、移码和插入/缺失突变衍生的变异。新开发的预测方法在TCGA数据库148例和已发表的57例匹配的WES和RNA-seq胰腺癌研究数据中进行验证，研究发现大部分胰腺癌含有可预测的高亲和力 MHC-Ⅰ新表位。

基于这个预测，研究者继续开发了临床前模型来描述该类患者的免疫逃逸分子和细胞机制。他们构建了一个基因定义的胰腺类器官模型（GDOs）,将三种表达不同新生抗原的GDOs（图1A-B）原位移植到免疫缺陷的小鼠中，肿瘤形成的发生率为100%(图1C)。相反，将其移植到免疫能力正常的小鼠中产生两种现象：1）免疫介导清除了所有表达新生抗原的肿瘤细胞（称为“无进展”）；2）免疫逃逸（称为“进展”）。此外也观察到有免疫能力的受试者在没有宏观肿瘤形成的前提下，也有小面积的阳性肿瘤区域，称为“中间”，反应一种免疫平衡状态（图1D-E）。"进展"的肿瘤重量明显小于无免疫选择压力的肿瘤类器官（图1F），暗示免疫逃逸前存在平衡状态。免疫逃逸肿瘤的类器官上的新生抗原和MHC-Ⅰ的表达均没有缺失，依然保留了新生抗原表达和抗原提呈的能力。

图1. 新生抗原表达的胰腺类器官模型免疫清除和免疫逃逸

2、免疫逃逸型肿瘤中新生抗原特异性CD8+T细胞表现为多功能障碍状态

前期人类PDAC研究结果显示，免疫逃逸性肿瘤中存在CD8+T细胞浸润情况，组织病理学分析显示瘤内和瘤间存在异质性。根据前期结果研究人员推测CD8浸润的免疫逃逸新生抗原表达可能在抗原处理提呈/呈递中出现缺陷，或者随着时间的推移出现肿瘤反应性T细胞功能失调。利用流式细胞技术评估新抗原特异性区内T性室内T细胞功能耗竭、功能障碍情况，研究发现无进展和进展的肿瘤CD8+T细胞丰度没有明显差别（图2A），但是在免疫逃逸的肿瘤中CD8+TILs增殖能力随着时间推移而下降（图2B）。检测新生抗原特异性TILs的共抑制受体（PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3）表达发现免疫逃逸类型的肿瘤中存在两种或两种以上共抑制受体表达（图2C），中间型抑制性受体PD-1+TIGIT+、PD-1+TIM3+和PD-1+LAG3+的共表达显著增加，暗示在免疫逃逸发生之前获得低功能表型。

为了进一步阐明免疫逃逸的机制，对免疫逃逸模型筛选出来的肿瘤内新生抗原特异性CD8+T细胞进行了单细胞RNA-seq。经过质控过滤后保留了447个新生抗原特异性的TILs，聚类成4个不同的簇（图2F）。识别4个簇中细胞间差异表达的基因，cluster 0主要聚类了CD8+T细胞衰竭相关基因(Pdcd1, Havcr2, Lag3, Tox)，两个较小的簇cluster 1和2主要表现出较高的naive/记忆标记物(Sell, Ccr7, Klf2, Tcf7)的表达，cluster 3表现出较高的抑制Ly49受体(Klra6, Klra7)。这些结果表明新生抗原特异性存在多功能状态。接下来再用流式细胞技术比较新生抗原特异性（CD44hiTetramer+）和非新生抗原CD8+TIL，结果如预期，CD44hiTetramer+明显存在更高比例的T细胞耗竭或功能失调，而非新生抗原特异性表现出旁观者效应。进一步对人PDAC新鲜手术样本中分离的瘤内CD8+T细胞进行流式分析以及对PDAC患者的单细胞测序数据进行分析得出了一致的结果，在临床前模型和人类PDAC中都有一群瘤内CD8+T细胞衰竭群体。

图2. T新生抗原特异性T细胞衰竭是免疫逃逸肿瘤中的典型状态

3、CD155/TIGIT在PDAC免疫逃逸中发挥重要作用

对小鼠PDAC免疫逃逸模型组织芯片和人PDAC样本抑制性配体表达PD-L1（PD-1配体）、Galectin 9（TIM-3配体）、CD155（TIGIT配体）进行免疫组化分析，发现PD-L1和Galectin 9表达水平不高，表现为偶尔阳性，绝大多数细胞呈阴性或低水平表达。与此相反，观察到大量的CD155表达水平升高。等位基因小鼠模型研究CD155表达水平与驱动基因状态的关系发现Kras或p53单独缺失时没有明显变化，在两者同时缺失时CD155表达显著增加，提示胰腺癌相关致癌事件之间存在相互作用，导致了CD155表达上调。结合新生抗原表位预测算法，根据新表位负荷将患者进行分层，发现含有预测新表位高负荷的肿瘤CD155表达水平显著高于新表位低负荷患者（图3）。研究人员推测CD155/TIGIT轴在PDAC免疫逃逸中发挥着重要作用：高表达的CD155蛋白激活细胞上的TIGIT受体，当TIGIT被激活后，T细胞进入耗竭状态，无法对胰腺癌细胞发起进攻。

图3. CD155在人和小鼠PDAC中表达情况

4、TIGIT/PD-1/CD40a联合免疫疗法在临床前模型中取得成功

接下来研究者希望使衰竭的T细胞恢复活力并刺激它们攻击胰腺癌细胞，CD40在抗原提呈细胞(APCs)表面表达，在APCs和T细胞之间的交流中起着至关重要的作用，因此在临床前小鼠模型中测试了PD-1，TIGIT抑制剂和CD40a激动剂不同组合的用药方式。研究发现单独使用PD-1或TIGIT抑制剂，或PD-1与TIGIT抑制剂联用对胰腺癌几乎没有作用；CD40a激动剂单药治疗导致11%的ORR和33%的DCR，但大多数动物单药治疗后又迅速进展；CD40a激动剂与PD-1或TIGIT联用主要表现为疾病稳定，并不能明显缩小肿瘤细胞。然而，TIGIT/PD-1共阻断加联用CD40a激动剂产生了显著的肿瘤应答（图4A-B, n=48），46% ORR,71%DCR,23%完全应答（mCR）,提示TIGIT封锁可能克服现有CD40a/PD-1治疗的耐药性。

图4. 不同用药方式应答情况

5、GeoMX DSP技术揭秘联合免疫疗法引起的胰腺癌组织空间免疫微环境变化

为了研究药物联用方案在胰腺癌组织空间内引起的免疫微环境变化和分子机制，研究者利用NanoString GeoMx DSP技术，对TIGIT/PD-1/CD40a治疗的样本进行空间蛋白水平检测。检测蛋白panel包括Immune Cell Profiling Core, IO Drug Target Module, Immune Activation Status Module, and和 Immune Cell Typing Module。在CD45，CD8a和PancCk形态学marker的指导下圈选感兴趣的区域，圈选区域包括肿瘤中心与肿瘤边缘，CD8_high与CD8_low，应答与非应答等，分析不同应答模式肿瘤免疫微环境空间水平的差异。在CD8-区（2只老鼠，11个AIOs）和CD8+区(3只老鼠，25个AOIs)分析差异蛋白表达情况。统计分析结果显示在应答动物模型中发现大量的肿瘤内CD8+T细胞浸润，而非应答动物中CD8+T细胞被排斥在肿瘤之外。同时在应答肿瘤的相邻间质内CD155和PD-L1表达明显升高，提示TIGIT/PD-1共阻断可克服CD40激动剂获得性耐药。对免疫细胞类群进行分析观察到治疗后，肿瘤应答者CD8+T浸润增加，免疫抑制性髓系亚群减少，尤其是粒细胞性骨髓源性抑制细胞（G-MDSC）。表明MDSC介导的T细胞排斥在治疗耐药中发挥着重要作用。探索联合用药后胰腺癌组织空间内引起的变化和分子机制，为该药物组合的科学性提供了强有力的证据。

图5. DSP部分结果

总结与提示

本研究从胰腺癌表达特异性新生抗原预测出发，通过使用表达新生抗原的PDAC的多个临床前模型，证实了肿瘤内新生抗原特异性CD8+T细胞具有多种功能障碍状态，人PDAC中也有类似的肿瘤内CD8+T细胞耗竭群体。在胰腺癌中发现了不同于PD-1/PD-L1的“刹车系统”-TIGIT/CD155，结合表达新生抗原PDAC的多个临床前模型与人类PDAC分析结果，提示CD155/TIGIT轴是维持PDAC免疫逃逸的重要条件。在此基础上开发了一种TIGIT/PD-1/CD40联合用药策略，在临床前小鼠模型得到了验证，后期进入临床试验阶段。目前胰腺癌在临床上仍然没有特别好的治疗策略，如果这种治疗在后期临床试验中取得好的结果，将会为胰腺癌患者带来福音，极大地推动胰腺癌的免疫治疗。在这个过程中GeoMx DSP技术从组织空间角度深度阐释了该策略背后的分子机制，在全面理解胰腺癌肿瘤微环境、空间异质性等方面有明显的应用价值和潜力，同时DSP完美结合单细胞测序既有细胞在组织中的空间排布信息又有该区域内存在的细胞类型及丰度信息，为今后类似研究提供很多的方法学指导。